Thérapie Génique De la Mucoviscidose

Patricia Lemarchand, INSERM U25, Faculté Necker-Enfants malades, Paris

(e-mail: lemarchand@necker.fr).

La mucoviscidose est une maladie autosomale récessive fréquente, associée à des anomalies du transport des électrolytes dans les cellules épithéliales. Les symptomes gastro-intestinaux et respiratoires dominent le syndrome clinique avec insuffisance respiratoire progressive dans près de 95% des cas. Dans les 20 dernières années, des avancées significatives ont été obtenues en terme de survie et de qualité de vie, et l'espérance de vie moyennes est autour de 30 ans alors qu'elle n'était que de 14 ans en 1969. Ce succès est probablement la conséquence de progrès dans le diagnostic, l'accès au traitement médical et les progrès thérapeutiques. Cependant la guérison pour la mucoviscidose reste un but encore inaccessible.

La mucoviscidose a été décrite dans les années 1930 comme une maladie du poumon et du pancréas. La transmission héréditaire n'a été clairement montrée qu'en 1940, où il a été suggéré qu'il s'agissait d'une maladie de caractère récessif. En 1952, les caractéristiques du diagnostic étaient définies comme un taux anormalement élevé de sodium et anormalement bas de chlore dans la sueur. Dans les années 1980, un défaut de la conductance au chlore lié à l'AMPcyclique était identifié dans les glandes sudoripares et les voies aériennes de sujets atteints de mucoviscidose.

Le fait que la protéine responsable de ce défaut de conductance n'était pas bien caractérisée empêchait l'identification du gène de la mucoviscidose par les techniques traditionnelles. Pour circonvenir cet obstacle un nouveau type de clonage génétique (clonage "positionnel") a été employé. Avec cette technique, le gène responsable d'une maladie est isolé grâce à l'étude de sa position sur la carte chromosomique, et la structure de la protéine et sa fonction sont ensuite déduites de la séquence génétique. Le gène de la mucoviscidose a ainsi été identifié en 1989 sur le chromosome 7. Environ 70% des sujets atteints de mucoviscidose ont une délétion de 3 paires de base, entrainant la perte d'une phénylalanine en position 508 (deltaF508) de la protéine mature. A cause de son rôle dans la conductance du chlore, le gène a été appelé cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR).

BASES MOLECULAIRES DE LA MUCOVISCIDOSE

Le gène CFTR compte 250 kb sur le chromosome 7q31-32. Il code pour une protéine transmembranaire qui fonctionne comme un canal chlore régulé par l'AMPc, avec d'autre rôles potentiels dans la biologie cellulaire épithéliale, notamment d'acidification du pH intracellulaire, de sulfatation et glycosylation des mucines, et peut-être de transporteur du glutathion. Les mutations du gène CFTR ont pour conséquence une fonction CFTR insuffisante dans la membrane apicale des cellules épithéliales, avec des conséquences cliniques premières dans l'épithélium respiratoire et gastro-intestinal. Plus de 500 mutations différentes ont été identifiées dans les 5 dernières années. La mutation prédominante (deltaF508), représentant 70% des cas, a pour conséquence une maturation anormale de la protéine CFTR qui ne parvient pas à la membrance apicale de la cellule. D'autres types de mutations ont été identifiés et classés en fonction de leur conséquence sur la protéine, qui peut être un défaut de production de CFTR, de maturation, de conduction, ou de régulation. La variété de ces mécanismes suggère que la thérapie qui sera applicable de façon la plus universelle possible devrait être dirigée au niveau génétique plus que fonctionnel de la maladie.

PRINCIPES DE LA THERAPIE GENIQUE DE LA MUCOVISCIDOSE

Le but de la thérapie génique est d'introduire du matériel génétique dans les cellules dans un but thérapeutique. Chez un sujet atteint de mucoviscidose, maladie autosomale récessive, apporter une simple copie du gène normal devrait corriger la maladie. La faisabilité du transfert de gène a d'abord été démontrée dans des cultures d'épithélium bronchique de sujets atteints de mucoviscidose. Quand l'ADNc normal codant pour CFTR est transféré in vitro dans les cellules épithéliales provenant d'un individu atteint, les anomalies biologiques cellulaires associées à la mucoviscidose sont corrigées. Il y a donc une "complémentation" des gènes endogènes anormaux par le gène transféré. Le transfert de l'ADNc normal du CFTR dans l'épithélium des voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose pourrrait donc être un traitement curatif de la mucoviscidose. Cependant, ce transfert du gène normal se heurte à de nombreuses difficultés.

Tout d'abord, transférer une copie du gène humain entier, avec ses éléments de régulation, tel que le gène de la mucoviscidose qui mesure 250 kb est inconcevable avec la technologie actuelle. C'est pourquoi l'ADNc du gène humain CFTR (7.5 kb) est utilisé, sans aucun élément de régulation.

Les autres obstacles au développement de la thérapie génique de la mucoviscidose sont dus à la pauvreté des informations sur la physiopathologie de la mucoviscidose, en particulier comment la fonction CFTR anormale donne réellement naissance à la mucoviscidose. En effet, il est présumé que les sécrétions dans les lumières bronchiques sont déshydratées en raison de l'hyperabsorption de sodium et l'hyposécrétion de chlore, entrainant une cascade d'infections et d'inflammation. Cependant les détails de la progression entre l'anomalie moléculaire de base et la survenue des manifestations cliniques respiratoires ne sont pas connus.

Ainsi, les cellules dans lesquelles le gène devrait être transféré ne sont pas bien identifiées. Il est en effet difficile de faire un parallèle entre l'expression de CFTR dans l'appareil respiratoire et le développement de la mucoviscidose. Chez les individus normaux, l'épithélium de surface des petites voies aériennes exprime de faibles quantités de CFTR, alors que les glandes muqueuses trouvées uniquement dans les bronches de gros calibre expriment des niveaux élevés de CFTR. Par contre, chez les sujets atteints de mucoviscidose, les conséquences pathologiques les plus importantes surviennent d'abord dans les petites voies aériennes, avec comme conséquence des lésions de l'épithélium alvéolaire.

Quel est le niveau d'expression de CFTR nécessaire pour corriger la maladie? Puisque les porteurs hétérozygotes de la mutation deltaF508 sont asymptomatiques avec seulement 50% d'expression normale CFTR, il semble logique que ce niveau d'expression soit le but à atteindre. Mais est-il indispensable de corriger 100% des cellules? In vitro un petit pourcentage de cellules nécessite d'être corrigé pour obtenir une normalisation globale de la conductance en chlore; ceci suggère qu'in vivo il ne sera pas nécessaire de corriger toutes les cellules. Cependant, des travaux récents ont montré que pour obtenir une normalisation de l'absorption de sodium, un pourcentage bien plus élevé de cellules doit exprimer le gène CFTR. L'importance de ces considérations n'est pas encore connue in vivo.

Un moyen intéressant d'étudier ces questions serait d'avoir un modèle animal pour la mucoviscidose. Plusieurs groupes ont développé des souris "knock-out" CFTR, n'exprimant aucune protéine CFTR. Cependant ces souris développent une pathologie digestive grave responsable d'une mortalité importante sans pathologie pulmonaire associée. De nouvelles souris ont été développées plus récemment, exprimant de bas niveaux de CFTR. Ces souris ont moins de complications digestives et, losqu'elles sont mises en contact avec du Pseudomonas (germe fréquemment rencontré au cours de la mucoviscidose, et très délétère) elles développent une pathologie respiratoire similaire à celle retrouvée chez le sujet humain atteint de mucoviscidose. Ces animaux pourraient donc être utilisés comme modèle pour tester de nouvelles stratégies de thérapie génique.

 

VECTEURS

L'ADNc du gène humain CFTR est le matériel génétique utilisé pour la thérapie génique de la mucoviscidose. L'ADNc est généralement exprimé par un promoteur constitutif hétérologue sans spécificité cellulaire ni élément de régulation. L'ADNc CFTR est délivré dans les cellules des voies aériennes par le moyen d'un "vecteur", soit biologique (viral) soit physico-chimique (non-viral). Les vecteurs peuvent être classés en fonction des caractéristiques suivantes (voir table 1): 1) Comment l'ADNc est délivré à l'intérieur de la cellule, 2) à quel endroit l'ADNc est situé par rapport au génome de la cellule (en position épichromosomale ou intégré au génome cellulaire), 3) combien de temps et à quel niveau l'expression du gène se produit, 4) comment l'hôte répond au vecteur et au produit du gène.

Liposomes

Les liposomes consistent à associer l'ADNc du CFTR à des particules lipidiques qui vont favoriser l'entrée de l'ADN dans la cellule à travers la membrane cytoplasmique. L'avantage majeur des vecteurs non-viraux repose sur le fait qu'ils n'utilisent pas de composant infectieux, et donc présenteraient moins de risque d'effets secondaires que les vecteurs viraux. Les liposomes ont été utilisés in vivo par voie intraveineuse chez la souris, avec expression du CFTR retrouvée dans les cellules pulmonaires, mais aussi dans le foie, le coeur, la rate et le rein (13). Ils ont aussi été utilisés en instillation intra-trachéale et en aérosol par 2 équipes anglaises chez la souris, et dans les 2 cas se sont révélés suffisamment efficaces pour corriger, au moins partiellement, le déficit en transport de chlore. Les complexes lipides/ADN transfectent une variété de types cellulaires, sont faciles à préparer, et peuvent transporter des gènes de très grande taille. Comparés aux adénovirus, leur toxicité est minimale, mais leur efficacité est nettement plus faible et les complexes ne sont pas très stables. Ils ont fait l'objet de plusieurs essais cliniques chez des sujets adultes atteints de mucoviscidose. Les efforts actuels pour améliorer l'efficacité du transfert de gène portent sur l'optimisation de la formule lipidique et l'augmentation de la stabilité lipide/ADN.

Adénovirus

L'utilisation des vecteurs viraux repose sur la propriété des virus de pénétrer dans les cellules et d'en modifier le programme génétique. Le nouveau gène est incorporé dans le génome viral et le virus recombinant est modifié pour pouvoir infecter les cellules, exprimer le nouveau gène, mais ne pas se reproduire dans la cellule hôte, pour éviter ainsi la dissémination de la nouvelle information génétique portée par le virus dans l'ensemble de l'organisme. Parmi les vecteurs viraux, l'adénovirus déficient pour la réplication est le mieux connu et le plus utilisé pour la thérapie génique de la mucoviscidose. Les cellules de l'épithélium bronchique se divisant très peu in vivo, les rétrovirus ne peuvent être utlisés pour transférer un gène dans l'epithélium des voies aériennes, car ils nécessitent la division de la cellule cible pour être efficaces.

Les vecteurs adénoviraux sont les vecteurs les plus employés actuellement pour transférer un gène dans l'appareil respiratoire. L'information génétique apportée par le vecteur adénoviral n'est pas intégrée dans le génome cellulaire, et n'est donc pas transmise à la cellule fille lors de la division cellulaire. Pour corriger une anomalie génétique héréditaire, les adénovirus devront donc être administrés de façon répétée. Les autres inconvénients des adénovirus sont: 1) l'expression des gènes adénoviraux entraînant des manifestations d'infection virale avec inflammation; 2) le risque de réplication virale in vivo (recombinaison avec un virus sauvage ou du matériel génétique viral déjà présent); 3) la nécessité d'administrations répétées; dans ce cas, le transfert de gènes pourrait être bloqué s'il existe une réponse immunitaire anti-virale. Les vecteurs adénoviraux représentent cependant le moyen le plus efficace actuellement pour transférer un gène dans l'appareil respiratoire. Par ailleurs, une étude récente montre que l'injection directe de vecteur adénoviral contenant l'ADNc CFTR dans le liquide amniotique chez le foetus de souris knock-out CFTR, permettrait d'empêcher chez ces souris le développement après la naissance des manifestations digestives habituelles similaires à la mucoviscidose. Cependant, ce travail reste controversé en raison de l'absence d'expression de CFTR chez la souris nouveau-né, comme si la correction trasitoire du "déficit" en CFTR au cours de la période foetale suffisait à empêcher le développement de la maladie.

Les vecteurs adénoviraux recombinants ont aussi été utilisés avec succès pour exprimer le CFTR in vitro et chez l'animal. Plusieurs protocoles d'administration d'adénovirus chez l'homme ont été effectués, aux Etats-Unis depuis mai 1993, et en France à l'automne 1995.

Adéeno-associated virus (AAV).

Les AAV sont des virus naturellement déficients pour la réplication, et qui n'ont jamais été associés à une pathologie chez l'homme. Les AAV offrent des avantages potentiels par rapport aux adénovirus: ils permettraient une intégration dans le génome (et donc une expression plus longue) et seraient peu immunogènes. Cependant, ils sont difficiles à cultiver, et ne peuvent transporter que des gènes de petite taille. L'ADNc CFTR représentant la taille maximale d'insertion, ceci pose un problème pour le choix du promoteur. De plus, les premières études expérimentales chez l'animal montrent le plus souvent une absence d'intégration dans le génome de la cellule in vivo, et la dissémination des AAV dans d'autres organes que le poumon. Malgré ces résultats peu favorables, deux essais cliniques ont été débutés récemment.

ESSAIS CLINIQUES (table 2)

Les essais cliniques de thérapie génique sont développés suivant des règles générales assez similaires dans le monde (mais probablement plus strictes en Europe). Le processus est le suivant: 1) Mettre au point l'étude et faire chez l'animal les expérimentations "pré-cliniques" in vitro et in vivo de faisabilité et d'inocuité, 2) Etablir le protocole clinique en détail et rédiger un formulaire détaillé de consentement éclairé avec les bénéfices et les risques potentiels pour le patient, 3) Obtenir l'autorisation des différentes autorités locales et nationales (NIH pour les USA, agence du médicament pour la France). Ces essais cliniques de phase I ont pour but d'évaluer si le matériel génétique peut faire exprimer l'ADNc normal du CFTR in vivo, ainsi que les complications potentielles de l'administration dans les voies aériennes de ce matériel génétique. Ils n'ont pas pour but de traiter la maladie, et s'adressent à quelques sujets adultes atteints de forme stable mais évoluée de mucoviscidose. Considérant les dangers potentiels et les difficultés d'administration de matériel génétique dans les poumons, certaines équipes ont adopté un protocole "conservateur", choisissant de tester uniquement la muqueuse nasale, très facilement accessible. Celle-ci a une morphologie et une fonction similaire à l'épithélium des voies aériennes inférieures, et l'épithélium nasal présente les anomalies ioniques typiques de la mucoviscidose. Cependant ces études limitées à la muqueuse nasale ne permettent pas réellement de prévoir les conséquences de l'injection de matériel génétique dans les voies aériennes inférieures. C'est pourquoi d'autres équipes ont choisi d'administrer le matériel génétique par voie intra-nasale et intra-pulmonaire ou par voie intra-pulmonaire seule. En avril 1993, un protocole d'essai incluant une dizaine de sujets adultes atteints de mucoviscidose, a débuté au National Institutes of Health aux Etats-Unis, avec instillation de vecteur adénoviral contenant l'ADNc du CFTR (vecteur mis au point en France), dans la narine, puis quelques jours plus tard dans un segment bronchique, par bonchoscopie; depuis lors d'autres centres américains ont effectué des essais similaires. Cependant, une pneumopathie aigue fébrile, régressive sans séquelle, est survenue dans le territoire d'instillation de l'adénovirus chez un des sujets lors de l'augmentation des doses. Ceci a entraîné la révision à la baisse des doses injectées d'adénovirus par l'ensemble des équipes américaines. Dans le même temps étaient publiés les résultats d'instillation nasale de vecteur adénoviral chez 3 sujets, montrant que le vecteur adénoviral contenant l'ADNc du CFTR était capable de faire exprimer le CFTR là où il avait été instillé, avec correction transitoire du déficit en transport de chlore. Un essai a également comporté l'administration répétée à quelques semaines d'intervalle du vecteur adénoviral dans les fosses nasales, montrant que l'efficacité du transfert de gène diminuait à chaque réadministration, probablement en raison du développement d'une immunité humorale de plus en plus forte. Enfin de nombreuses équipes cherchent à créer de nouveaux vecteurs adénoviraux, contenant moins de génome de l'adénovirus et qui pourraient donc entraîner moins d'effets secondaires.

Plusieurs essais cliniques ont été récemment effectués avec administration dans les fosses nasales de liposomes associés à l'ADNc CFTR. Au cours de ces essais randomisés en double aveugle, aucune toxicité n'a été notée, mais la présence de l'ADNc CFTR transféré n'a été retrouvée que pendant quelques jours, avec correction partielle du déficit en sécrétion de chlore, là aussi très transitoire.

CONCLUSION

La thérapie génique de la mucoviscidose est encore balbutiante, malgré des efforts intenses et un développement rapide. Les premiers essais cliniques ont montré des résultats encourageants mais aussi des difficultés importantes. Le transfert de l'ADNc a pu être démontré chez l'homme, à la fois de façon moléculaire et fonctionnelle. Cependant les résultats sont variables, l'expression est transitoire, et la mise en évidence du transfert de l'ADNc CFTR ne corrèle pas toujours avec la correction fonctionnelle. Enfin, il y a de sérieuses inquiétudes sur la toxicité des vecteurs adénoviraux, qui pourraient limiter l'emploi de fortes doses et donc l'efficacité du transfert. Dans le même temps, de nombreuses possibilités existent pour le développement de nouvelles stratégies. Développer le traitement optimal nécessitera beaucoup de temps, un optimisme prudent reste donc de mise. Un objectif important reste le conseil aux patients et à leur famille pour garder l'espoir, sans annoncer précipitamment l'imminence de résultats tangibles.

Table 1

Caractéristiques des différentes méthodes de transfert de l'ADNc CFTR dans l'appareil respiratoire, à partir des études cliniques et pré-cliniques.

Adénovirus AAV Liposomes ______________________________________________________________

Etudes animales

-Immunité humorale déclenchée + +/- -

par une dose

-Immunité cellulaire déclenchée + - -

par une dose

-Preuve moléculaire du + + +

transfert de gène

-Correction phénotypique + ? +

chez la souris CF

-Nécessité d’injections + ? +

répétées

-Efficacité maintenue avec - ? ?

les doses répétées

Etudes chez l’homme

-Immunité humorale déclenchée +/- NR -

par une dose

-Immunité cellulaire déclenchée ? NR -

par une dose

-Preuve moléculaire du +/- NR +/-

transfert de gène

-Correction phénotypique +/- NR +/-

chez la souris CF

-Nécessité d’injections + NR +

répétées

-Efficacité maintenue avec - NR ?

les doses répétées

_______________________________________________________________

NR: non réalisé

 

 

 

Table 2

Thérapie Génique de la Mucoviscidose: Résultats des Premiers Essais Cliniques

Equipe Vecteur Cible Détection Correction Toxicité Durée

Gène/Expr. DDP Loc./Gén. Expr.

__________________________________________________________________

Welsh Adéno. nez (3)* + +/- - - qq jours

(93)

Crystal Adéno. nez (4)* + + + + qq jours

(94) bronche

Boucher Adéno. nez (12)* + - + - qq jours

(95)

Geddes Liposomes nez (9)* + +/- - - qq jours

(95) (double aveugle)

Welsh Adéno. nez (6)* + +/- - - qq jours

(96) (doses répétées)

Hyde Liposomes nez (12)* + +/- - - qq jours

(97) (double aveugle)

Innes Liposomes nez (16)* + +/- - - qq jours

(97) (double aveugle)

Bellon Adéno. nez (6)* + ? - - qq jours

(97) bronches (aérosol)

___________________________________________________________________

Expr: expression; DDP: différence de potentiel (mesure à la surface de l'épithélium permettant d'évaluer les échanges en chlore, et donc de mesurer une éventuelle correction des troubles ioniques habituellement retrouvés chez les sujets atteints de mucoviscidose); Loc: locale; Gén: générale; Adéno: vecteur adénoviral.

*: nombre de sujets inclus dans le protocole.

REFERENCES

Alton EWFW, Geddes DM. Gene therapy for cystic fibrosis: a clinical perspective. Gene Therapy 1995; 2:88-95.

Curiel DT, Pilewski JM, Albelda SM. Gene therapy approaches for inherited and acquired diseases. Am J Respir Cell Mol Biol 1996; 14:1-18.

Davis PB, Drumm M, Konstan MW. Cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 1996; 154: 1229-1256.

Larson JE, Morrow SL, Leo Happel, JF Sharp, JC Cohen. Reversal of cystic fibrosis phenotype in mice by gene therapy in utero. Lancet 1997; 349:619-620.

Rosenfeld MA, Collins FS. Gene therapy for cystic fibrosis. Chest 1996; 109:241-252.

Verma IM, Somia N. Gene therapy- promises, problems and prospects. Nature 1997; 389:239-242.

Wagner JA, Gardner P. Toward cystic fibrosis gene therapy. Annu Rev Med 1997; 48:203-216.

Wilson JM. Gene therapy for cystic fibrosis: challenges and future directions. J Clin Invest 1995; 96:2547-2554.