JTA 2001

Particularités de la fécondation in-vitro en vue d’un diagnostic pré-implantatoire

Dr C.Rongières, S.Viville, J. Ohl, K.Bettahar-Lebugle, C.Wittemer

Centre d’AMP Centre médico-chirurgical et obstetrical Schiltigheim
Service de Gynécologie-Obstétrique Pr I.Nisand

1.Introduction

La prise en charge d’un couple en vue d’un diagnostic pré-implantatoire (DPI) se plie aux règles habituelles des couples infertiles mais est soumise à quelques contraintes d’ordre technique. L’expérience belge nous a largement guidé et nous évite les écueils dans lesquels ils sont eux-mêmes tombés à leur début.
Il ne faut pas perdre de vue que l’objectif est d’aider ces patients à avoir un enfant même porteur, mais indemne de la pathologie transmissible. Cette condition n’est pas en soi suffisante pour accepter en DPI tous les couples mêmes si les techniques de dépistage existent. Le résultat de la tentative de FIV est primordiale à double titre: elle permettra la naissance d’un enfant sain dans une famille le plus souvent déjà blessée par une parentalité douloureuse et elle s’adresse à des couples fertiles qui ont déjà obtenus des grossesses spontanément. Ces couples sont transposés dans un univers qui leur est inconnu et qu’ils n’imaginaient pas aussi complexe et incertain. Le screening des patients doit être sérié afin d’éviter de les entraîner dans des procédures compliquées qui n’aboutiraient pas de façon prévisible.
Le choix des techniques de laboratoire et les stratégies de transfert sont importantes pour la qualité du DPI et l’amélioration des chances de grossesse tout en diminuant les contraintes du biologiste responsable du diagnostic définitif.

2.Stratégie d’inclusion en FIV en vue d’un DPI

La fécondation in vitro (FIV) qui généralement permet l’obtention de plusieurs embryons offre aux couples à risque de transmettre une maladie génétique d’établir le statut génétique de leurs embryons et de ne transférer que les embryons sains ou porteurs sains. Une cohorte suffisante d’embryons assure la présence d’au moins un embryon sain. Cette nécessité d’obtenir plusieurs embryons est due à l’influence de la pathologie sur le nombre d’embryons non atteints et transférables, à la perte de matériel entre la ponction et le transfert et à l’influence du nombre d’embryons sur le taux de grossesses. Vandervost et al (1998) ont très bien montré (Tableau I) la corrélation entre la pathologie héréditaire et le nombre d’embryons non atteints. De même le nombre de complexe cumulus ovocyte (CCO) est significativement lié aux taux de grossesses (Tableau II) avec un taux croissant de grossesses en fonction du nombre d’embryons transférés chez ces mêmes couples (Tableau III), élément que l’on connaît bien en AMP. Liebears et al montrent que moins de 50% des CCO obtenus donneront des embryons biopsiables (Tableau IV). Ainsi, ce sera sur des critères classiques qu’il faudra sélectionner les patientes avec une extrême vigilance puisque Vandervost propose l’annulation des cycles à moins de 6 follicules espérés et qu’entre 6 et 8 l’annulation doit être discuter avec le couple.

Tableau I : Influence de la pathologie sur le nombre d’embryons non atteints et transférés

Pathologie
Héréditaire

Monogenic
recessif

Monogenic dominant

Lié à l’X

Sex-aneuploïdie

Cycles (n)

29

33

14

8

CCO (n)

405

398

221

116

E Biopsiés (n)

133

202

111

40

E normaux

84

35

35

18

E normaux/CCO

0.21

0.16

0.16

0.15

Par E biopsié

0.63

0.31

0.31

0.45

CEI

019

0.14

0.13

0.20

a,b P< 0.00005 c P< 0.005 dP< 0.05 Vandervost et al Hum Reprod 1998
CEI: cycle efficiency index CCO: Complexe cumulus-ovocyte

Tableau II : Caractéristiques des cycles quand < 9 et = 9 CC0 prélevés

Caractéristiques

Nbre de CCO

 

< 9

=9

Nbre de cycles (% du total)

22 a (26.1)

62 a (73.9)

Total de CCO prélevés

124

1020

Nbre de cycle avec E biopsiés (%)

18 (82)

59 (95)

Nbre d’E biopsiés (±SD)

2.23 ± 1.57 b

7 ± 4 b

Nbre de cycles avec TE (%)

14 c (63.6)

54 c (87)

Nbre d’E normaux/ CCO

0.14

0.18

Nbre de TE/cycle (±SD)

0.77 ± 0.69 d

1.94 ± 1.05 d

Nbre d’E /transfert (±SD)

1.21± 0.68 e

2.22 ±1.05 e

Implantation/E (%)

20

13

Grossesses/cycles (%)

2/22 (9)

13/62 (20.9)


a,b,d,eP< 0.0005 cP<0.05

Tableau III : Influence du nombre d’embryons transférés sur le taux de grossesse

Nbre d’embryons transférés

0

1

2

3

4

Nbre de cycles

16

22

24

21

1

Nbre de grossesses (%)

0 (0)

2 (10.1)

5 (18.1)

7 (33.3)

1 (100)

 

Tableau IV: Annulation des cycles (Liebears et al 1998 )

Moyenne du nombre de CCO 12.3
Ovocytes Meta II 10.9
Ovocytes injectés 10.6
2PN 8.4
Embryons biopsiés 5.8

< de 50% des ovocytes donneront des embryons biopsiables

- L’âge de la patiente est un facteur prédictif puissant de bonne réponse aux stimulations de l’ovulation. Le déclin de la fertilité commence à partir de 35 ans et à partir de 40 ans tous les aspects de la FIV sont touchés malgré l’augmentation des doses: diminution du pic d’estradiol, nombre de follicules recrutés, nombre d’ovocytes recueillis et taux de grossesses significativement plus bas que chez des patientes jeunes. Pour Hull et col (1996) le taux de naissances vivantes après transfert embryonnaire est de 32,2% entre 25 et 29 ans et de 8,8% entre 40 et 44 ans.
S’il est difficile de refuser d’emblée d’inclure une patiente en AMP pour âge élevé (40-42 ans) cela l’est d’autant plus dans le cadre d’un DPI où les patientes sont à priori fertiles.
- Les dosages hormonaux au troisième jour du cycle (J3) seront donc un bon corollaire à l’âge pour prendre une décision. Le taux de FSH à J3 reste le meilleur paramètre pour l’instant et le plus reconnu. Il existe une variabilité des dosages en fonction des cycles et en fonction des laboratoires ce qui amène à les contrôler au moins une fois. Un taux de FSH = 12 mUI/ml est considéré comme pathologique mais chaque centre possède son seuil de référence en fonction du laboratoire avec lequel il travaille. La FSH de base ne peut s’interpréter sans la présence de l’estradiolémie à J3. Licciardi et al (1995) n’ont aucune grossesse pour un estradiol supérieur à 75 pg/ml. Les taux d’estradiolémie sont inversement proportionnels aux taux de FSH par effet de feed-back négatif. Ainsi une FSH normale est faussement rassurante si on retrouve une estradiolémie élevée. Cette proposition est vraie en dehors du syndrome des ovaires polykystiques qui présentent une estradiolémie physiologiquement élevée.
L’inhibine B à J3 est un troisième marqueur qui commence à se répandre. Un taux <= 45 pg/ml marque une insuffisance ovarienne débutante et d’après Siefer et al (1999), serait diminuée avant l’augmentation de la FSH. De nouvelles études discutent ces résultats rendant les taux de FSH de base seuls performants (Corson et al 1999 )
- Les tests de réserve ovarienne peuvent contribuer à prendre une décision dans les cas difficiles, en particulier chez des femmes entre 39 et 41 ans et pour lesquelles les taux de base de FSH ou d’estradiol sont limites. Le test au citrate de clomiphène (TCC) ou l’exogenous FSH ovarian reserve test (EFORT) sont deux tests rapides, simples et qui permettent d’évaluer la réponse de l’ovaire à la stimulation. Une élévation de la FSH à J3 et à J10 à plus de 10mUI/ml après traitement de 5 jours de 100 mg de CC ou un delta < 30 pg/ml d’estradiol entre J3 et J4 et après 300 UI de FSH à J3 mettent en évidence une insuffisance ovarienne qui ne répondra pas au traitement de stimulation de l’ovulation. Chez des patientes jeunes cependant une élévation de la FSH ne doit pas faire reculer devant une tentative de FIV. Certaines études montrent un taux de réussite cumulée satisfaisant mais seulement dans le cadre de l’infertilité où le but est l’obtention d’une grossesse même avec un faible recueil ovocytaire. La nécessité d’obtenir un nombre suffisant d’embryons pour aboutir à un transfert change considérablement les données du problème.
Ainsi, un bilan mettant en évidence une patiente qui répondrait peu ou pas à une stimulation d’ovulation en vue d’un DPI doit amener à rediscuter l’indication et éventuellement à ne pas l’intégrer dans un protocole (C.Rongières-Bertrand et al 1997)

- L’imagerie permet d’objectivé la qualité de la cavité utérine et donc de l’accueil de l’embryon, ce d’autant qu’il existe des antécédents de curetage ou de fausse couche tardive. L’hystéroscopie est supérieure à l’hystérographie pour diagnostiquer les petites lésions intra utérines (polypes, myomes, synéchies) et les pathologies de la muqueuse (hyperplasie, atrophie, endométrite). Un traitement chirurgical adéquat sera proposé avant tout traitement de stimulation.
- Le spermogramme est à demander même si l’ICSI est la technique de choix pour un DPI. Il permet d’éviter les mauvaises surprises le jour de la ponction (OATS sévère, azoospermie) et si besoin de rechercher des anomalies génétiques ou autres devant des pathologies découvertes à ce moment là (caryotype parental, anticorps antispermatozoïdes, infection).

3.Choix de la stimulation

Le choix de la stimulation doit se faire en fonction du profil hormonal de la patiente comme dans une AMP classique. Il n’y a pas de légitimité à proposer une hyperstimulation de l’ovulation contrôlée « forcée ». Les risques d’hyperstimulation sont vrais également pour ces patientes. Il s’agit plutôt d’adapter le traitement afin d’obtenir environ une dizaine follicules. L’existence de trois centres de DPI en France amène les gens à consulter loin de chez eux. Les centres d’AMP locaux font relais et permettent le déplacement des patientes juste pour le jour de la ponction ovocytaire. Il est souvent plus facile pour le centre qui effectue le DPI de prescrire le traitement de stimulation et de le monitorer avec le centre relai. Ceci permet de fixer ensemble les dates de début de traitement, de suivre les monitorages sur des traitements connus et ainsi de pouvoir annuler à distance avant de déplacer les patients. L’échec de stimulation ou l’annulation du traitement est alors sous la responsabilité du centre de DPI, ce qui facilite la relation triangulaire patient, centre relais et centre DPI.

4. Choix de l’ICSI

La technique de l’injection intracytoplasmique de spermatozoïde (ICSI) est aujourd’hui la technique de choix pour un DPI. La PCR en général et en particulier sur une ou deux cellules nécessite minutie et vigilance. Il s’agit d’éviter toute contamination par de l’ADN extérieur: en particulier celui de l’opérateur, l’ADN volatile des PCR antérieures mais aussi les cellules du cumulus ou d’autres spermatozoïdes qui peuvent venir polluer le prélèvement de blastomère si l’embryon a été fécondé en fécondation in vitro classique.
A ces critères se rajoutent également la diminution du risque d’échec de fécondation. Staessen et al (1999) montrent qu’il existe un petit avantage à l’ICSI en minimisant les risques d‘échecs de fécondation sans oblitérer les chances de développement embryonnaire et d’implantation potentielle. (Tableau V )


Tableau V : Fertilisation à 2PN dans une cohorte d’ovocytes traités par FIV ou ICSI

 

FIV
(n=334)

ICSI
(n=328)

 

Tous Patients (n=56)
N° de CCO


6.0 ± 2.2


5.9 ± 2.3

 

2PN/CCO (%)

53.0 ± 31 .2

62.0 ± 26.6

NS


Sans EF (n=47)
N° de CCO

 

6.1 ± 2.2

 

5.9 ± 2.3

 

2PN/CCO (%)

60.3 ± 25.6

63.8 ± 25.2

NS

Avec EF en FIV (n=7)
N° de CCO


5.9 ± 1.8


6.2 ± 1.9

 

2PN/CCO (%)

-

69.2 ± 15.3

 


Avec EF en ICSI (n=2)
N° de CCO

 

4.0 ± 1.4

 

3.5 ± 0.7

 

2PN/CCO (%)

56.6 ± 33.0

-

 


EF : échec de fertilisation 

5.Le transfert embryonnaire

Le diagnostic pré implantatoire se fait en général à J3 de la culture embryonnaire dans le but d’obtenir un embryon entre 4 à 8 cellules pour un diagnostic par PCR ou FISH au mieux sur deux blastomères d’un même embryon. Grifo et al (1998) ont transféré à J4 après un DPI par PCR effectué le 3ème jour. Ils ont retrouvé sur 7 couples intéressés, un taux de d’implantation de 37,5% avec un taux d’enfant vivant / transfert de 25% dont une grossesse gémellaire. Ils concluent qu’il n’y a pas d’effets adverses au transfert à J4 alors qu’il existe non seulement une plus grande sécurité au diagnostic génétique mais aussi une possibilité d’augmenter le nombre de recherches possibles du fait du temps imparti au biologiste. De plus ils soulignent l’augmentation de taux d’implantation bien qu’il s’agisse d’une petite série.
Gianarolli et al (1999) ont effectué chez 86 patientes de mauvais pronostic (échecs répétés d’implantation, indication de caryotype pour âge maternel, translocation) 116 cycles de FIV. Deux groupes ont été individualisés; le groupe 1 qui a bénéficié d’un transfert à J3 en fin d’après midi avec une analyse par FISH des chromosomes XY, 13,16,18 et 21 et un deuxième groupe dont les embryons ont été transférés à J4 le matin avec une analyse par FISH des chromosomes précédents plus le 14,15 et 22. Cette technique se faisait alors en deux temps. (Tableau VI). Leurs conclusions sont similaires à l’équipe de Grifo avec un commentaire supplémentaire développant le bénéfice en terme de sélection d’embryons sains et viables à J4 sans contrainte de temps pour le biologiste comme pour la patiente.

Tableau VI : Devenir des embryons biopsiés congelés ou non congelés

 

Embryons biopsiés

Embryons non biopsiés

Nombre de patientes

30

43

Age (année ; moyenne ±SD)

36.3 ± 3.7

36.1 ± 2.8

Nombre d’embryons décongelés

55

94

Intacts (%)

5a (9)

24a (25)

Lysés (%)

19b (34)

12b (13)

Index de survie %

38c

61c

ac 2= 4.98 ; P<0.025
bc 2 = 8.71 ; P<0.001
cc
=48.11 ;P<0.001

   

Veiga et al (1999) ont publié les résultats de trois patientes dont le DPI a été fait à J3 et le transfert entre J5 et J6. Leurs résultats montrent l’absence de dommages de la biopsie embryonnaire sur le développement embryonnaire jusqu’au stade blastocyste. De plus, ils évoquent la possibilité d’un DPI à J5 permettant l’obtention de plus de matériel. On sait qu’il peut exister des mosaïques avec aneuploïdies à ce stade sans connaître encore leur conséquence pathologiques et la capacité de réparation de ces embryons (Wells et al 2000).
Les transferts en France sont actuellement réalisés à J3 en fin d’après midi. La littérature préconise les transferts à J4 et il n’est pas impossible qu’un transfert à J5-j6 après maîtrise de la culture prolongée soit un jour proposé.
Comme il n’y a pas de légitimité à hyperstimulation forcée, il n’y a pas de légitimité à transférer plus de deux embryons chez ces femmes en général fertiles. La politique de transfert doit rester la même qu’en AMP classique pour éviter à ces couples des grossesses multiples. Les grossesses multiples chez ces patientes présentent les mêmes risques que chez les autres avec la certitude actuellement d’un diagnostic génétique anténatal pour confirmer le DPI. L’amniocentèse n’est pas sans risque supplémentaire dans ces grossesses.

6. La congélation embryonnaire

La congélation des embryons sains surnuméraires n’a pas aujourd’hui donné de résultats satisfaisant. Van Steitegheim n’a aucune grossesse après transfert d’embryons sains biopsiés ayant subit un cycle de congélation-décongélation. Magli et al (1999) ont comparé des embryons après décongélation. Le groupe 1 comprenait 55 embryons biopsiés décongelés et le groupe 2 comprenait 94 embryons sans biopsies décongelés. Le pourcentage d’embryons intacts après décongélation est significativement plus élevé dans le groupe 2 (25% vs 9% ;P<0.025). Ils décrivent un index intéressant : l’index de survie qui correspond au nombre de blastomères vivants divisés par le nombre de blastomères totaux congelés. Cet index est significativement plus élevé dans le groupe 2 (61% vs 38% ; P< 0.001. Dans un deuxième temps, ils ont analysé par FISH des embryons qui avaient été congelés pour hypestimulation ovarienne. Ils ont été décongelés puis biopsiés puis transférés. Ils retrouvent 52% d ‘aneuploïdie, 19% (3/19) de grossesses évolutives et 10% d’implantation. Les auteurs préconisent qu’à l’heure actuelle il est préférable de ne pas congeler les embryons biopsiés jusqu’à la mise au point d’un protocole congélation-décongélation qui soit approprié et qui passerai par une ouverture de la zone pellucide moins agressive. Ludwig et al (1998) ont montré chez la souris, que congélation et biopsie sont possible.
Aujourd’hui, la congélation peut être conseillée aux couples avec toute la prudence nécessaire dans les chances de réussite.

7.Conclusion

Le DPI est possible du fait de l’acquisition de plusieurs embryons en FIV ouvrant la probabilité d’obtenir un embryon sain au moins. Les choix des techniques de fécondation et de congélation sont intimement liés à la performance du DPI. Les inclusions en vue d’un DPI , le choix de stimulation et de transfert doivent être soumis à une réflexion drastique plus encore que dans le cadre de l’infertilité. L’écoute du couple à tous ces endroits doit être supportée par des psychologues mais également par les cliniciens et généticiens de l’équipe. La contrainte d’un traitement de stimulation en FIV n’est pas sans effet sur la représentation déjà ébranlée de leur capacité à se reproduire.  

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